ELISA试剂盒使用注意事项全解析

酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒在生物学研究和临床检测中应用广泛，但在使用过程中有一些事项需要特别注意，以确保实验结果的准确性和可靠性。

一、样本方面

1. 采集与处理
   • 在采集样本时，要严格按照试剂盒要求进行。例如不同类型的试剂盒适用于血清、血浆、细胞培养上清等不同样本类型，不可混淆。对于血清样本采集，采血后需及时离心，离心速度一般在1000 - 3000rpm，离心10 - 15分钟，避免溶血。因为在以HRP为标记酶的ELISA测定中，溶血标本中的血红蛋白会影响显色结果。
   • 样本采集时间和体位也可能影响结果。像可的松在早晨4 - 6点会有峰值，检测此类物质要选择合适的采集时间；测定与体位有关的物质（如肾素活性），体位变化可能使检测结果大幅波动。
   • 处理后的样本如果不能及时检测，保存方法很重要。一般血清标本以无菌操作分离可在2 - 8℃保存一周，有菌操作可冰冻保存，长时间保存应在 - 70℃以下，并且要避免反复冻融，否则会造成蛋白分子破坏，出现假阴性结果。
2. 标本量准确性
   • 在加样环节，无论是定性还是定量测定都需保证标本量的准确性。定性测定加样时使用相同口径滴管，保持准确姿势；定量测定时则要按照规定配制标本和结合物的稀释液，准确加样，并且将液体加在孔底，防止加在孔壁上部和产生气泡。

二、试剂方面

1. 储存与使用
   • 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。因为温度差异会影响试剂活性和反应效率。稀过后的标准品不可保存。
   • 实验所用试剂应与其他试剂分开存放，不同批号的试剂不可混用。不用时，试剂盒中的板条要放回包装袋密封，其他试剂要包装好。某些试剂如底物A要防止挥发（避免长时间开盖），底物B对光敏感，要避免长时间光照和接触皮肤眼睛。
2. 加样顺序与准确性
   • 加试剂顺序要一致，保证所有反应板孔温育时间相同。加试剂时避免产生气泡，不同试剂滴加速度也有要求，如在使用滴瓶滴加国产试剂盒中的试剂时，速度过快会出现重复滴加等问题，影响结果。

三、操作过程方面

1. 温育
   • 严格控制孵育温度和时间，一般孵育温度37℃左右。时间不同试剂盒有差异，过长或过高的温度会增加非特异性结合产生假阳性，过低或过短则可能导致反应不完全产生假阴性。
2. 洗板
   • 洗板是关键步骤，要使用合适的洗涤液且保证洗涤充分。采用浸泡式或喷洗式洗板，次数一般为3 - 5次，洗涤不充分会使背景值过高。
3. 显色与终止
   • 显色过程中关注颜色变化时间点，终止反应要及时准确。终止液是酸性溶液，注意避免接触皮肤和眼睛。
4. 结果判读与仪器使用
   • 使用酶标仪读取结果前先校准，选择正确波长（如TMB底物检测波长约450nm）。根据试剂盒标准曲线和参考范围判定结果，对于可疑结果可重复实验。